Dentro del conjunto de leches fermentadas, el yogur ocupa un lugar preeminente por la tradición y el volumen de su utilización como alimento. El yogur es "el producto de leche coagulada obtenido por fermentación láctica mediante la acción del Lactobacillus bulgaricus y el Streptococcus termophilus a partir de leche pasteurizada, leche concentrada pasteurizada, leche en polvo entera, semidesnatada o desnatada, suero en polvo, proteínas de leche y/u otros productos procedentes del fraccionamiento de la leche" (1).

La aceptación, por parte de la Administración española, del yogur pasteurizado después de la fermentación, supone que no existe una condición indispensable respecto de la viabilidad de los gérmenes en el producto terminado para que el consumidor se beneficie de los efectos salutíferos de este.

En esta situación, este Informe es el resultado de la investigación de las posibles diferencias entre dos presentaciones de yogur: el clásico con las bacterias productoras vivas en su comercialización, otro con esas bacterias pasteurizadas después de la fermentación.

De otra parte, si los gérmenes citados fueran la condición de la mejoría de la condición de malabsorción de la lactosa no diagnosticada, encontraríamos diferencias entre los tests de sobrecarga al aplicarlos a sujetos que hubieran ingerido yogures con gérmenes vivos respecto al consumido del otro tipo.

Bajo esta perspectiva hemos diseñado un trabajo de investigación en el que se plantean 4 objetivos independientes, aunque complementarios todos ellos referidos a población sana, en el supuesto básico de que los yogures no son un medicamento sino un alimento de consumo entre personas sanas.

1º. Estudio de la supervivencia en intestino de los gérmenes productores del yogur (L. Bulgaricus y S. Termophilus) como condición de su comportamiento como prebióticos (3).

2º. Posibles diferencias de los efectos sobre los parámetros que miden la inmunidad general, producida por la acción de los yogures clásicos, en relación con los pasteurizados después de la fermentación.

3º. Posibles diferencias de los efectos sobre el bienestar gastrointestinal de los yogures con las bacterias starter viables, en comparación con los efectos de los yogures con las bacterias pasteurizadas después de la fermentación.

4º. El anterior objetivo se complementa con el estudio de las diferencias en los resultados de los tests de intolerancia a la lactosa después de la ingestión de uno u otro tipo de yogur.

La población sana base del estudio ha sido reclutada voluntariamente entre la usuaria del Servicio de Salud Laboral tanto la trabajadora como la general (estudiantes), mediante anuncio de petición de voluntarios en los carteles de anuncios de la Facultad de Medicina y en el periódico del Hospital.

Criterios de inclusión y exclusión:
Hemos considerado sanos los que no manifestaron molestias intestinales en los quince últimos días anteriores a una entrevista somera, ni en los que posteriormente encontramos, en las pruebas analíticas que se les realizaron, datos de alteración general o digestiva.

Diseño
El Grupo Leche Pascual nos ha suministrado dos tipos de yogures utilizados en recipientes idénticos, salvo una etiqueta que los identificaba como Alpes ó Pirineos.

Los yogures tipo Alpes correspondían a los yogures pasteurizados, en los que no se detectó ninguna bacteria viva mediante cultivo en medio selectivo adecuado. Por otro lado los yogures tipo Pirineos correspondían al típico yogur que mantiene una población bacteriana viable de 107 unidades formadoras de colonias por gramo (UFC/gr.) de producto para cada una de los dos tipos de bacterias. Uno de los yogures contenía por tanto, 125 millones de gérmenes (Estreptococos termófilos y Bacilos bulgáricos).

Se comprobó la carga bacteriana durante las diferentes tandas del estudio, así como de una misma tanda a lo largo de las semanas, resultando ser en todos los casos una carga de alrededor de 107 UFC/gr. tanto para Lactobacillus como para Streptococcus.

El diseño experimental consistió en la recogida en todos los voluntarios incluidos en el estudio de un total de tres muestras de sangre y de heces y la respuesta a una encuesta de satisfacción gastrointestinal (encuesta GIQLI) en diferentes tiempos.

Una vez que un individuo hubo sido incluido en el estudio (1ª visita) se le asignó al azar el tipo de yogur a ingerir en el primer período. Las primeras muestras basales (Tiempo 0) se recogieron tras una semana de ausencia de yogur en la dieta. La finalidad de esta muestra fue la de descartar la presencia de poblaciones autóctonas de las bacterias del yogur en estos individuos.

Tras estas primeras muestras, los voluntarios se dividieron en dos grupos a los que se asignó la toma de yogures bien tipo Alpes o bien tipo Pirineos y se incluyó también un tercer grupo control que no ingirió ningún tipo de yogur. Cada grupo tomó 3 yogures al día del tipo que le correspondió durante quince días, al final de los cuales se recogieron las segundas muestras de sangre y heces (Tiempo 1). Posteriormente se incluyó un período de lavado de quince sin yogur en la dieta, y de nuevo volvieron a ingerir 3 yogures al día durante quince días del tipo contrario al de la primera ronda, recogiendo las últimas muestras sanguíneas y fecales (Tiempo 2).

Por tanto, en una primera visita o momento cero del estudio, a todos los participantes se les ha realizado la encuesta, un primer análisis basal de heces e inmunología. Además se les ha instruido en el seguimiento de una dieta normalizada que incluye 3 yogures al día del tipo que se les entrega. La duración del primer periodo de tratamiento fue de 15 días, al finalizar los cuales, en una 2ª visita (momento uno del estudio) se ha recogido de nuevo el cuestionario GIQLI y tomado muestras de sangre y heces. Después de 15 días de período de lavado en la que han seguido su dieta exenta de yogur, en una tercera visita los participantes recibieron los yogures correspondientes al segundo período también de 15 días de duración. En el tiempo de lavado a los sujetos de la investigación se les ha realizado el test del hidrógeno como referente de la intolerancia a la lactosa. Al finalizar, en la última visita, se ha recogido otra vez el cuestionario GIQLI, y se les ha tomado una tercera muestra de sangre y heces, en el momento dos del estudio.


Variables determinadas
Hemos medido por medio de la encuesta GIQLI sobre Calidad de Vida gastrointestinal la correspondiente a la de los participantes, habiendo modificado alguno de sus ítems para adaptar la encuesta a la población sana dado su origen de población enferma. Esta modificación fue realizada después de analizar las respuestas de los primeros 20 voluntarios sanos que fueron consideradas, por ello, como prueba piloto.

El Cuestionario GIQLY lo constituyen 36 preguntas, cada una admite 5 respuestas, codificadas de 0 a 4 (cuanto más alta, mayor calidad de vida). En el artículo original (4) se propone usar su suma como índice (el rango de 0 a 144). No se dice nada sobre si la distribución es normal, pero todo el análisis se hace como si lo fuera. Se muestra un histograma de cambio después de la cirugía y es razonablemente normal. El índice está desarrollado para evaluar la calidad de vida en pacientes con enfermedad gastrointestinal aunque se usaron individuos normales como control. Para estos, en las preguntas que incluyen la frase "due to your disease" se ha cambiado por "due to your health", que podemos traducir por "como consecuencia de su estado de salud".

Como referencia: la media y desviación estándar del índice, en sanos, fueron 125,8 y 13.0 respectivamente, mientras que en los enfermos fue:
- 105 (12,5) enfermos con movilidad en la comunidad
- 89 (16,5) enfermos confinados en casa y
- 45 (14,8) enfermos encamados.

En un artículo posterior (5) en el que se valida el índice para pacientes con "cáncer periampular potencialmente operable" se propone usar el índice total y 4 subíndices parciales: Bienestar físico, síntomas gastrointestinales: digestión, síntomas gastrointestinales: defecación y bienestar mental. Se dice explícitamente que tanto el índice total como los subíndices tienen una distribución normal. Las medias y desviaciones típicas figuran en la tabla.

Estudio inmunológico
Además de las variables de edad, sexo, trabajo actual, pautas alimentarias y otras similares, como posibles variables modificadoras del efecto, registradas al comienzo del trabajo, los parámetros inmunológicos se han registrado en tres ocasiones: al principio y al final (ante y post) del primer ciclo de ingesta de yogures y al final del segundo de acuerdo con el diseño.

La medición en sangre de los parámetros que traducen la situación inmunológica (cuantificación de las inmunoglobulinas IgA, IgG e IgM, leucocitos, neutrófilos y linfocitos totales y de estos los linfocitos CD3 positivos, los CD4 positivos y los CD8 positivos), nos ha suministrado la información para juzgar los efectos sobre la inmunidad.

Test de malabsorción de la lactosa
En lo referente a la malabsorción de la lactosa, se ha realizado a los participantes el test del hidrógeno después del primer ciclo de ingestión, para comprobar si después de la ingestión de los yogures clásicos, los voluntarios positivos al test eran significativamente menos que los que ingirieron los pasteurizados.

Muestra
Hemos trabajado con un total de 114 voluntarios de los cuales 42 han recibido en el primer periodo tres dosis diarias de 125 cc del yogur denominado Alpes y en segundo el denominado Pirineos, 54 la secuencia inversa; 18 voluntarios no han ingerido ningún tipo de yogur permaneciendo como población control.

El Cuadro final de participantes fue el siguiente:
- Varones: 49
- Mujeres: 65
- Media de peso: 66,1 Kg.
- Media de talla: 170,4 cm.
- Media de edades: 23,6 años

Como los 20 primeros sirvieron como población piloto en lo referente a la Encuesta los resultados de la misma después de su adaptación se refieren a 94 participantes.

Un voluntario no participó en el estudio bacteriológico.

Nueve voluntarios no realizaron las pruebas de sobrecarga de lactosa.

Citometría de flujo
Se ha utilizado un citómetro Epics-XL Beckman-Coulter. Las muestras de sangre periférica (0,1 ml) se incuban durante 10 minutos simultáneamente con 10 mcL de los anticuerpos monoclonales anti-CD4-FICTC, anti CD8-PE y anti-CD3-PC5 (Coulter). Cumplida la incubación se procesan en forma automatizada en el sistema TQ-prep (Coulter) y se pasan por el citómetro usando como ventana de análisis la correspondiente a los linfocitos en representación biparamétrica FS/SS. Para cada muestra se procesa en idénticas condiciones el correspondiente control isotópico (coulter). Los rangos de normalidad son CD3, 68-88 %; CD4 38-58 %; CD8 28-38 %.

Análisis de las células sanguíneas
Se recogen muestras de sangre en ayunas y se analizan mediante los autoanalizadores Cell- Dyn 4000, Coulter LH 750 y Gens- S Coulter Beckman. Los rangos de normalidad son Leucocitos 4000-11000; Neutrófilos 1700-7500; Linfocitos 1000-3500. mcL

Para el análisis se utilizó el Gastrolyzer EC60 Breath H2 Monitor (Bedfont scientific Ltd.) y en caso de duda sobre el resultado se comprobó la medición con el aparato Lactoscreen (Hoek Loos Medical). La duración de la prueba es de dos horas con determinaciones de H2 basal, cada 15 minutos en la primera hora y cada 30 minutos en la segunda hora. La prueba se prolonga 30 minutos más en caso de resultado positivo. El sustrato administrado fue de 25 gramos de lactosa diluida en agua. Se considera la prueba positiva cuando hubiera un ascenso de 20 ppm de Hidrogeno en las tomas postbasales.

Se usó el método descrito por Fleiss (5) para estudios cruzados, que permite contrastar tanto la existencia de "efecto arrastre" (diferencia entre ambos periodos independientemente del tratamiento recibido) como el efecto del tratamiento, este último efecto se contrasta diferentemente dependiendo de que haya o no, efecto arrastre.

Para variables continuas el método consiste en calcular las sumas y las diferencias de las determinaciones en los dos periodos. El efecto arrastre se contrasta comparando, con la prueba de la t de Student, las medias de las sumas en las dos secuencias posibles del orden de administración de los tratamientos. El efecto del tratamiento, si no hay efecto arrastre, se contrasta comparando las medias de las diferencias. Si hubiera efecto arrastre, el efecto del tratamiento se contrasta comparando las medias de ambos tratamiento en el primer periodo.

Para variables binarias, el efecto arrastre se contrasta comparando las proporciones de respuestas positivas en las dos secuencias. El efecto del tratamiento, si no hay efecto arrastre, se contrasta comparando las proporciones de respuestas positivas de cada tratamiento sólo entre los individuos en que el primero fue superior al segundo. Si hubiera efecto arrastre, el efecto del tratamiento se contrasta comparando las proporciones de respuesta positiva a cada tratamiento en el primer periodo. Todas las comparaciones de proporciones con la prueba Ji2. Adicionalmente, en caso de no existir efecto arrastre, se comparan ambos tratamientos con el periodo basal mediante análisis de la varianza de bloques completos aleatorios (6) para las variables continuas y con la prueba de McNemar para las binarias.

Además, y a modo de control, se realizó un análisis de la varianza de bloques completos aleatorios en las variables continuas del grupo control.

Se ha analizado la significación estadística de los resultados procedentes tanto de la Encuesta GIQLI como de las pruebas de laboratorio realizadas (heces, sangre y aire exhalado)

No se han encontrado diferencias estadísticamente significativas en ninguna de las variables siguientes:
- Índice de bienestar físico de la encuesta
- Índice de síntomas gastrointestinales: Defecación
- Coprocultivos
- Test de hidrógeno
- Neutrófilos
- Linfocitos
- IgA
- IgM
- Linfocitos CD3 positivos
- Linfocitos CD4 positivos
- Linfocitos CD8 positivos

Solamente se han encontrado diferencias estadísticamente significativas pero sin relevancia clínica alguna en las siguientes variables:
- Indice total de la encuesta
- Índice de bienestar mental
- Índice de síntomas gastrointestinales: Digestión
- Leucocitos
- IgG

Los resultados que ofrecen algún tipo de diferencias son los siguientes.

1. Encuesta

1 i) Análisis por el método de Fleiss para estudios cruzados

1 ii) Análisis de la varianza de bloques completos aleatorios:
En este análisis no se considera el orden de la secuencia, pero permite comparaciones con las determinaciones basales.

Medias y (Errores típicos de las medias)

Es decir, hay un efecto muy pequeño, clínicamente irrelevante, pero estadísticamente significativo, en el índice total y los subíndices bienestar mental y digestión a favor del yogur denominado Alpes.


2 Variables analíticas

2 i) Análisis por el método de Fleiss para estudios cruzados

2 ii) Análisis de la varianza de bloques completos aleatorios:
En este análisis no se considera el orden de la secuencia, pero permite comparaciones con las determinaciones basales.

Medias y (Errores típicos de las medias)

Es decir, que los leucocitos están más altos (256,76) después de tomar Alpes que después de tomar Pirineos mientas que las IGG están más bajas (25,87) datos siempre dentro de la normalidad y sin significación clínica.

3º. Al no haber encontrado diferencias significativas en los resultados del test de exhalación de hidrógeno aplicado a voluntarios sanos, después de la ingestión de los yogures y con la sistemática citadas, podemos mantener que la influencia en la intolerancia a la lactosa no es diferente tras la ingestión de los yogures clásicos o de los pasteurizados.

4º. Al no haber encontrado diferencias significativas en las respuestas a los diversos ítems de la Encuesta de Calidad Gastrointestinal, adaptado para sujetos sanos, después de la ingestión de los yogures y con la sistemática citadas podemos mantener que no existe una influencia en el bienestar gastrointestinal de sujetos sanos después de la ingestión de los yogures clásicos, diferente de la producida por la ingestión de los yogures pasteurizados.

5º. En resumen NO HEMOS ENCONTRADO DIFERENCIAS EN LOS EFECTOS MICROBIÓLOGICOS, INMUNOLÓGICOS O DE BIENESTAR DIGESTIVO ENTRE LOS YOGURES TRADICIONALES Y LOS PASTEURIZADOS.